為了增進對該法規(guī)指南的直觀操作體驗，銳拓儀器參考Potiwa Purazi等的《Assessment of “Sameness” and/or Differences between Marketed Creams Containing Miconazole Nitrate Using a Discriminatory in vitro Release Testing (IVRT) Method》的數(shù)據(jù)，并按照FDA的SUPAC-SS指南中的“相同性”驗收標準對兩種已上市的非專利產(chǎn)品進行了測試和評估，以此展示IVRT工具如何用于半固體制劑體外釋放研究及其后續(xù)的處方篩選工作，提供一個模擬真實運用場景的操作實例給廣大研究同仁參考。

1.1.物料

1.1.1.化學試劑與參考標準品

氫化可的松（HC）標準品

硝酸咪康唑（MCZ）標準品

硝酸益康唑（ECZ）標準品：內(nèi)標物

已上市的氫化可的松霜Emo-Cort 1%：GlaxoSmithKline Inc，用于性能驗證測試（PVT）。

參比制劑Daktarin®霜（2%）：Janssen Pharmaceutica，用作參考產(chǎn)品，以開發(fā)和驗證IVRT方法。三種含有1%、2%和4%MCZ的特制霜配方也用于確認IVRT方法的靈敏性、特異性和選擇性。

經(jīng)批準且已上市的仿制配方Dermazole®霜劑（2%）：Sandoz公司，與參比制劑進行比較，以證明該方法用于評估“相同性”和/或檢測差異。

經(jīng)批準且已上市的仿制配方Covarex®霜劑：與參比制劑進行比較，以證明該方法用于評估“相同性”和/或檢測差異。

1.1.2.HPLC色譜法

使用液相色譜法進行測試樣品的含量檢測，用于分析PVT和IVRT樣品的HPLC系統(tǒng)配備了Waters Alliance 2695型分離模塊，該模塊包括在線脫氣模塊、自動取樣器和光電二極管陣列（PDA）檢測器

Waters®Empower 3軟件用于數(shù)據(jù)采集和處理。使用METTLER®AE 163型分析天平對參考標準品和霜進行稱重。P100和P1000微量移液管用于轉(zhuǎn)移和稀釋標準溶液和樣品溶液，液相色譜測試條件見下表：

表1液相色譜測試條件

1.1.3.IVRT 測試系統(tǒng)

使用基于Franz擴散池原理的透皮系統(tǒng)進行方法開發(fā)，膜暴露表面積為1.767 cm²，供體室和受體室由選定的合成膜隔開。

1.2.方法

1.2.1.HPLC方法驗證

根據(jù)國際協(xié)調(diào)委員會（ICH）關(guān)于線性和范圍、精密度、重復(fù)性、準確度、特異性以及確定的定量限（LOQ）和檢測限（LOD）的指南，驗證IVRT樣品定量的HPLC方法。

1.2.2.測試設(shè)備的機械驗證

作為機械驗證的一部分，評估了VDC的容量和直徑、接受介質(zhì)的溫度、攪拌速度、上樣的樣品體積以及VDC系統(tǒng)所處的環(huán)境條件。根據(jù)USP<1724>要求對VDC進行機械參數(shù)確認。

驗證中需要計算單位面積采樣時間釋放量所需的每個VDC的孔的直徑和容量分別通過測量長度和重量確定。使用重量法評估每個VDC的容量。用游標卡尺測量孔的直徑確定膜暴露面積。

溫度保持在32±1°C，以模擬皮膚溫度并避免擴散系數(shù)的變化。在用純化水填充VDC并平衡30分鐘后，用經(jīng)過校準的數(shù)字溫度計測量六個VDC中的接收介質(zhì)溫度，確認溫度達到預(yù)設(shè)要求。

使用激光轉(zhuǎn)速表在500rpm下評估六個VDC之間的攪拌速度準確性與均勻性

所有物理參數(shù)測量3次。根據(jù)預(yù)定義的驗收標準，計算平均值（x）和變異范圍（V），以確定六個VDC的準確性和測試池之間變異性。機械驗證的驗收標準根據(jù)USP通用<1724>。

1.2.3.性能測試(PVT)

使用1%氫化可的松（HC）進行PVT測試，測試條件如下：

表2 PVT測試條件

1.2.4.硝酸咪康唑（MCZ）接收液研究

評估MCZ在pH 4.5接收液（50/50 v/v）（乙醇：0.05 M磷酸鹽緩沖液）中的溶解度，一式三份。稱量藥物并放入空VDC中，加入接收液以獲得飽和濃度。將MCZ溶液在32±0.5℃下攪拌6小時。然后停止攪拌，樣品靜置過夜。提取上清液的等分試樣，過濾、稀釋并分析，以確定溶解的MCZ的濃度。理想情況下，在整個IVRT過程中，藥物在接受液中的溶解度應(yīng)大于藥物最大預(yù)期濃度的10倍。

1.2.5.膜篩選實驗

使用各種合成膜進行膜篩選，例如Magna Nylon、Tuffryn，乙酸纖維素，纖維素酯和Strat-M。通過在32±1°C下，將每個單獨的膜浸入含有250µg/mL MCZ的10mL測試溶液中，在pH 4.5接受液（50/50 v/v）（乙醇：0.05M磷酸鹽緩沖液中，以一式兩份的方式研究MCZ在各種膜上的結(jié)合。平行評估了一組無膜對照MCZ溶液?？赡艽嬖谝驗樗幬锱c膜的結(jié)合和/或其在接收液中的穩(wěn)定性，為了確定MCZ含量的任何變化，使用上述HPLC方法測定所有測試溶液的濃度。此外，進行了IVRT試驗，以比較兩種膜（尼龍膜和Tuffryn膜）的釋放情況。

1.2.6.硝酸咪康唑（MCZ）IVRT方法設(shè)計

硝酸咪康唑（MCZ）設(shè)計的測試條件見表3：

表3硝酸咪康唑（MCZ）IVRT方法設(shè)定

智能真空脫氣儀

1.2.7.釋放速率計算

使用Higuchi模型，假設(shè)存在完美漏槽條件且在偽無限劑量下，使用方程（1）確定釋放率?？紤]到由于替換取樣量而導致的接收液稀釋，并使用方程（1）計算不同取樣時間下接收液中MCZ的濃度（Cn）。

式子中,

Qn：單位面積在時間（n）釋放的量，單位為µg/cm²

Cn：不同取樣時間下接收液中的藥物濃度（n），單位：µg/cm3

Vs：樣品體積（cm³）

Vc：擴散池體積（cm²）

Ac：膜暴露面積（cm²）

釋放速率則為Qn與時間平方根曲線的回歸線斜率，參見USP<1724>

1.2.8.IVRT方法驗證

線性、精密度和重現(xiàn)性

使用參考產(chǎn)品Daktarin®霜（2%）進行了三次IVRT試驗，在不同天測試（n=6），以確定線性、精密度和重現(xiàn)性。為了符合Higuchi模型的假設(shè)，單位面積的釋放量應(yīng)與時間的平方根呈線性關(guān)系。

通過使用方程（2），從獲得的18個釋放率中估算實驗內(nèi)和實驗間的變異性來確定精密度和重現(xiàn)性

式子中,µ=估計平均釋放速率

σ1：實驗間標準偏差

σ2：實驗中標準偏差

靈敏度、特異性和選擇性

IVRT方法的靈敏度、特異性和選擇性，在VDC（n=6）的三次IVRT試驗中進行了評估，每個VDC使用含有1%、2%和4%MCZ的霜，這些霜是特別配制和臨時制備的。通過測定釋放速率隨MCZ濃度的變化，驗證IVRT方法的靈敏度，并通過評估釋放速率與測試產(chǎn)品中MCZ濃度的比例來表征特異性。以釋放速率為因變量，以MCZ濃度為預(yù)測變量的線性回歸模型用于估計確定相關(guān)系數(shù)（R²）。

為了測試IVRT方法是否有選擇性，以準確辨別產(chǎn)品性能差異，使用USP<1724>章節(jié)中描述的統(tǒng)計方法，將含有2%MCZ的霜與具有較高和較低MCZ濃度的測試產(chǎn)品進行比較。此外，IVRT方法準確證明“相同性”的能力，通過Daktarin®霜（2%）與自身的兩兩比較進行測試。

耐用性

分別在30°C和34°C下評估了該方法在標稱溫度（即32°C）下對微小波動（±2°C）的耐用性。

劑量消耗

為了確保IVRT實驗期間沒有過量的劑量消耗，能夠使用線性、精密度和重現(xiàn)性測試的結(jié)果，應(yīng)計算產(chǎn)品的劑量消耗，確保為偽無限劑量，偽無限劑量以回收率Recovery表示，使用方程（3）計算回收率。

回收率Recovery=最后一個時間點接受液中MCZ的累積量/產(chǎn)品強度×施加劑量（3）

1.2.9.評估含有2%MCZ的霜之間的“相似性”/差異

比較IVRT研究按照FDA的SUPAC-SS指南進行。測試產(chǎn)品，即兩種經(jīng)批準和上市的仿制配方，Dermazole®霜（2%）和Covarex®霜（2%），與參考產(chǎn)品Daktarin®霜（2%）進行了比較。根據(jù)SUPAC-SS指南，將VDC隨機分配給測試（T）和參考（R）產(chǎn)品。將從R和T釋放的藥物的單個累積量與時間的平方根作圖。使用非參數(shù)統(tǒng)計方法Mann-Whitney U檢驗來計算R和T之間斜率比率的90%置信區(qū)間（CI）。由于IVRT實驗期間預(yù)計會出現(xiàn)一些異常值（例如，由于氣泡形成），因此使用了能消除該影響的Mann-Whitney U檢驗。

1.2.10.IVRT方法應(yīng)用

使用兩種不同濃度（0.5%和1%）的MCZ霜，通過用含水霜稀釋Daktarin®霜（2%）來研究IVRT方法檢測制劑差異的能力。將這些稀釋產(chǎn)品與市售Daktarin®霜（2%）產(chǎn)品進行比較。

2.1.HPLC方法驗證

HPLC方法的驗證參數(shù)符合ICH指南規(guī)定的預(yù)定義驗收標準，HPLC方法驗證的結(jié)果見表4：

表4 HPLC方法驗證結(jié)果

機械性能驗證

VDC的機械性能符合USP 1724中對于機械性能的要求。

2.2.性能確認測試(PVT)

PVT實驗符合預(yù)定義的驗收標準，結(jié)果如表5所示。所得數(shù)據(jù)證實了IVRT系統(tǒng)的適用性和重現(xiàn)性。

表5 PVT數(shù)據(jù)

2.3.硝酸咪康唑（MCZ）接收液研究

在對緩沖液的不同pH和摩爾濃度進行初步實驗后，選擇了50%乙醇和50%0.05M磷酸鹽緩沖液（pH 4.5）作為IVRT的接收液，因為MCZ在該組合物中高度可溶。MCZ在接受液中的溶解度為3671µg/mL（±60.24），比方法驗證實驗期間獲得的樣品中的最高測量濃度（150µg/mL）高10倍以上，確保滿足漏槽條件。

2.4.濾膜篩選實驗

尼龍、醋酸纖維素和Tuffryn膜的平均回收率分別為98.40%、95.10%和98.45%，表明其與MCZ結(jié)合可忽略不計。因此，膜不太可能作為MCZ的限速屏障。相反，Strat-M和纖維素酯膜顯示出低的MCZ回收率，不符合±10%的可接受范圍。

實驗6小時后，使用尼龍和Tuffryn膜對Daktarin霜（2%）中MCZ的體外釋放進行比較，結(jié)果顯示釋放率分別為86.64µg/cm²/min½和76.68µg/cm²/min½。綜合考慮釋放率、可用性和經(jīng)濟性，選擇了成本較低的尼龍膜作為濾膜。

2.5.IVRT方法驗證

線性、精密度和重現(xiàn)性

當R2>0.9時，確認線性。根據(jù)SUPAC-SS指南，使用線性回歸計算3次試驗（n=6）的18個釋放率。所有釋放速率均顯示單位面積釋放到接收液中的藥物量（µg/cm2）與時間平方根之間的線性關(guān)系（R2>0.99）。

變異性參數(shù)等于σ1=36.14，σ2=27.56，µ=57.86µg/cm²/min½，導致實驗間變異性的變異系數(shù)為10.39%，實驗內(nèi)變異系數(shù)為9.07%。CV<15%證實了可接受的精密度和重現(xiàn)性。

靈敏度

平均釋放率隨MCZ濃度的增加而增加：對于含有1%、2%和4%MCZ的霜，平均釋放率分別為14.56µg/cm²/min½（±4.84）、39.92µg/cm²/min½（±6.00）和73.55µg/cm2/min½（±3.78）。則認為該方法是靈敏的，因為含有1%MCZ的霜產(chǎn)生的平均釋放率顯著低于含有2%MCZ的霜，而含有4%MCZ的霜產(chǎn)生的平均釋藥率最高。

特異性

觀察到MCZ濃度與釋放速率之間的線性關(guān)系（R2=0.9935）（圖1）。因為測試產(chǎn)品的平均釋放率與MCZ濃度成比例增加，證實了IVRT方法的特異性。

選擇性

2%MCZ霜與1%和4%MCZ霜的配對比較，表明改方法能夠準確識別“不同”的產(chǎn)品，而參考產(chǎn)品與自身的比較則證實了“相同性”的確定（表6）。（下表改為表7）

表6 MCZ乳膏的配對比較

耐用性

使用不同溫度（即30°C和34°C）進行IVRT試驗的平均釋放率分別為55.14µg/cm²/min½（±8.15）和72.53µg/cm²/min½（±9.00）。平均釋放率與在標稱溫度（32°C）下進行的IVRT試驗（即59.30µg/cm²/min½（±7.27））得出的平均釋放率之間的偏差沒有超過15%，因此，證實了開發(fā)的IVRT方法對實驗過程中溫度微小波動的耐用性。

劑量消耗

為測試線性度、精密度和重現(xiàn)性而進行的IVRT試驗中觀察到的回收率分別為<30%，即27.11%（±2.00）、28.20%（±2.41）和29.75%（±3.26），這表明在既定的實驗條件下不可能出現(xiàn)任何劑量耗盡，滿足偽無限劑量要求。

2.6.評估含有2%MCZ的霜之間的“相似性”/差異

圖2和表7分別顯示了參考產(chǎn)品Daktarin霜（2%）與兩種經(jīng)批準和上市的仿制制劑Dermazole®霜（2%）和Covarex®霜的釋放曲線和成對比較。

表7 參考產(chǎn)品與仿制制劑的配對比較

與參考產(chǎn)品Daktarin霜（2%）相比，Dermazole®霜的90%置信限（2%）落在SUPAC-SS驗收標準（75–133.33%）的范圍內(nèi)，確認了兩種霜之間的“相同性”，而與參考產(chǎn)品Daktarin軟膏（2%）以及Dermazole®霜相比，Covarex®霜完全超出了可接受范圍，表明這些霜不具有藥物等效性。

局部劑型性能標準的差異，可以通過考慮Q1、Q2和Q3來解釋，Q1、Q2和Q3分別指定性和定量數(shù)值以及劑型微觀結(jié)構(gòu)。使用Covarex®霜觀察到的藥物釋放曲線的差異可能是由于賦形劑的差異（Q1/Q2）。Covarex®霜含有咪唑烷基脲（0.2%）、尼泊金甲酯（0.15%）和尼泊金丙酯鈉（0.15%），而Daktarin®和Dermazole®霜含有苯甲酸（0.2%）。輔料的這些差異可能會改變藥物制劑的物理化學性質(zhì)、皮膚滲透性、溶解度和熱力學活性以及制劑的Q3屬性。

由于制備方法的不同，檢測配方差異的研究結(jié)果如圖3所示

Daktarin®霜中MCZ的釋放率（2%）明顯高于1%和0.5%MCZ霜（圖3）。這可能是由于Q3的差異，即與物質(zhì)的微觀結(jié)構(gòu)和排列的差異，以及Q1/Q2的差異有關(guān)，圖3所示的釋放曲線表明，IVRT系統(tǒng)可以區(qū)分使用不同規(guī)格，不同制劑工藝的制劑。

根據(jù)美國食品和藥物管理局阿昔洛韋軟膏和霜指南草案、SUPAC-SS非無菌半固體劑型指南和USP通用章節(jié)的建議，對已批準和上市的外用MCZ霜進行體外評價。一種仿制霜Dermazole®霜（2%）與參考產(chǎn)品Daktarin®霜（2%）表現(xiàn)出“相同”，而另一種仿制軟膏Covarex®霜（%），其MCZ釋放率不在75–133.33%的接受標準范圍內(nèi)，則認為不具有體外等效性。兩種仿制霜之間的比較，表明它們在體外并不等同。

總之，開發(fā)良好的IVRT方法，能夠準確區(qū)分不同規(guī)格產(chǎn)品的體外釋放率，這可以反映產(chǎn)品性能的相似性和/或差異。此外，結(jié)果表明，IVRT方法還具有檢測配方變化的能力，這可能是由于Q1/Q2/Q3不同所造成的。經(jīng)驗證的IVRT系統(tǒng)提供了證據(jù)，方法能夠準確評估仿制的配方外用霜產(chǎn)品中MCZ的釋放。結(jié)果證實了IVRT方法適用于以可靠和可重復(fù)的方式，測量局部皮膚霜中MCZ的釋放率，并為將來使用此類產(chǎn)品獲得生物豁免，提供了令人信服的數(shù)據(jù)。在銳拓的下一次本固體制劑分享中，我們將接著這次的分享，展示使用IVRT來構(gòu)建IVIVC，敬請各位同仁關(guān)注。

參考原文：《Assessment of“Sameness”and/or Differences between Marketed Creams Containing Miconazole Nitrate Using a Discriminatory in vitro Release Testing(IVRT)Method》

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實驗系統(tǒng)

Experimental System

實驗儀器：銳拓 RT800 自動取樣透皮擴散系統(tǒng)