多年來，垂直擴(kuò)散池，又稱為Franz擴(kuò)散池，一直被用于研究藥物分子的皮膚傳導(dǎo)。這種簡單的體外方法對于測量藥物經(jīng)皮膚轉(zhuǎn)運(yùn)和/或滲透到皮膚中的速率和程度非常有用。如果應(yīng)用了相關(guān)的皮膚模型，則它是評估經(jīng)皮藥物吸收的有用工具，特別是當(dāng)目的是評估新藥候選物或篩選用于皮膚應(yīng)用的新藥模擬物時(shí)。在過去的幾十年里，垂直擴(kuò)散池的使用也成為局部和透皮藥物產(chǎn)品性能測試的重點(diǎn)。然而，當(dāng)體外試驗(yàn)旨在評估局部或透皮產(chǎn)品在生產(chǎn)后、保質(zhì)期內(nèi)或放大和批準(zhǔn)后變化后的質(zhì)量(SUPAC，下載鏈接見本文末尾部分)時(shí)，基于皮膚的擴(kuò)散模型不再適用。使用人皮膚或動(dòng)物皮膚的試驗(yàn)方法當(dāng)然需要了解各種藥劑在目標(biāo)物種皮膚上的過程、途徑和驅(qū)動(dòng)力，但由于皮膚特性的種內(nèi)和種間可變性較大，不適用于產(chǎn)生對質(zhì)量控制(QC)至關(guān)重要的可再現(xiàn)和穩(wěn)健的試驗(yàn)條件。因此，出于QC目的，IVRT的目標(biāo)是關(guān)注物理屬性(溶解度、微觀粘度、乳液狀態(tài)、粒度等)可能影響藥物從半固體制劑中釋放行為，則皮膚必須用適當(dāng)?shù)哪ご妗?/span>同時(shí)在IVRT實(shí)驗(yàn)中，必須明確定義與藥物釋放相關(guān)的所有檢測參數(shù)，以獲得一種有區(qū)分力且耐用性良好的QC檢測方法。

本研究目的是參考Sandra Klein及銳拓實(shí)驗(yàn)室的研究成果，展示不同實(shí)驗(yàn)參數(shù)對垂直擴(kuò)散池中獲得體外藥物釋放曲線（IVRT曲線）的影響，也同時(shí)展示IVRT方法開發(fā)過程中，實(shí)驗(yàn)室方法開發(fā)人員需要考慮的部分內(nèi)容，以減少IVRT方法開發(fā)中的存在的問題。

2.1膜材料和孔徑的影響

采用組成和稠度不同的兩種凝膠制劑Voltaren® Emulgel®和Diclofenac-ratiopharm Gel，探索了膜材料和孔徑對體外擴(kuò)散速率的影響。溶出介質(zhì)為pH 7.4的磷酸鹽緩沖液，攪拌速度為800 rpm。根據(jù)FDA 《In Vitro Release Test Studies for Topical Drug Products Submitted in ANDAs Guidance for Industry》，釋放速率為累積釋放量對時(shí)間平方根的回歸曲線的斜率r。結(jié)果如圖1所示。

溶出曲線表明，膜材料和孔徑均可對雙氯芬酸凝膠制劑的體外擴(kuò)散速率產(chǎn)生影響。盡管所測試的大多數(shù)膜的結(jié)果沒有很大差異，但當(dāng)使用PET膜時(shí)，兩種配方的擴(kuò)散速率都要高得多。然而，這很可能是使用這種膜引起的偏差。由于很難將PET膜固定到位，且PET膜易起皺，因此未將其用于后續(xù)研究?？傮w而言，聚砜(Tuffryn)膜被視為最合適的膜，用于后續(xù)篩選實(shí)驗(yàn)。

2.2溶出介質(zhì)pH的影響

雙氯芬酸是一種弱酸，其鈉鹽的pKa值為4.0(25°C)。根據(jù)藥物的酸堿性，預(yù)計(jì)受體介質(zhì)的pH值會(huì)影響擴(kuò)散速率。為了考察溶出介質(zhì)pH的影響,使用pH為7.4、6.5和5.0的三種不同pH的溶出介質(zhì)，考察了溶出介質(zhì)pH對Voltaren® Emulgel® 和 Diclac® Schmerzgel的擴(kuò)散速率、藥物釋放的影響。使用Tuffryn膜分離制劑和溶出介質(zhì)，用磁棒和螺旋攪拌器以800 rpm攪拌溶出介質(zhì)。結(jié)果見圖2。

正如預(yù)期，在pH 7.4的磷酸鹽緩沖液中，兩種配方的藥物釋放速率最高。溶出介質(zhì)越接近藥物pKa值，藥物釋放速率減慢，這在Diclac® Schmerzgel的釋放曲線中尤其明顯。在pH 5.0緩沖液中，藥物濃度達(dá)到了一個(gè)平穩(wěn)值，這反映了雙氯芬酸在該pH值下的溶解性差，也表明當(dāng)實(shí)驗(yàn)旨在考察漏槽條件下的藥物釋放時(shí)，該緩沖液不合適。為了達(dá)到漏槽條件，受體介質(zhì)必須具有高溶解或帶走藥物的能力，并且受體介質(zhì)中的藥物濃度不應(yīng)超過釋放基質(zhì)中藥物溶解度的10%(<1724> SEMISOLID DRUG PRODUCTS—PERFORMANCE TESTS)。由于新候選藥物的漏槽條件很難確定，因此在開始釋放實(shí)驗(yàn)之前，應(yīng)測定化合物在推薦溶出介質(zhì)中的溶解度，以確保選擇正確的溶出介質(zhì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對于雙氯芬酸等酸性藥物，當(dāng)目的是觀察不受pH影響下的解離(可通過Hendersson-Hasselbalch方程計(jì)算)和藥物化合物溶解度阻礙的擴(kuò)散時(shí)，溶出介質(zhì)應(yīng)為pKa 加至少2個(gè)pH單位。

2.3脫氣的影響

我們進(jìn)行了多次對接受介質(zhì)使用前脫氣和不脫氣對照實(shí)驗(yàn)。每當(dāng)介質(zhì)未脫氣且氣泡出現(xiàn)在膜下時(shí)，這將導(dǎo)致溶出速率大大降低(取決于氣泡的數(shù)量和大小)。然而，繪制藥物釋放量(μg)與的關(guān)系圖仍可得出線性關(guān)系，這也是USP1724進(jìn)行IVRT分析時(shí)要求使用Higuchi模型分析數(shù)據(jù)的原因。而使用脫氣機(jī)可以用于介質(zhì)的脫氣并有效地改善氣泡問題。

2.4攪拌速度和攪拌器類型的影響

使用Voltaren Emulgel作為試驗(yàn)配方，研究了不同攪拌速度和不同攪拌器類型(即帶有和不帶有附加螺旋攪拌器的磁性攪拌棒)的影響(見圖6)。結(jié)果清楚地表明，攪拌速度和攪拌器類型對釋放/擴(kuò)散速率都有影響(圖3)。

圖3左所示的結(jié)果表明，在擴(kuò)散池底部使用簡單的磁性攪拌棒（下圖）并不是最佳攪拌器模式，尤其是在低攪拌速度下，流通池中的流體力學(xué)不足以進(jìn)行充分混合。圖3中所示的曲線還表明，對于每種攪拌器類型，都存在臨界攪拌速度。使用磁性攪拌棒進(jìn)行充分混合需要非常高的攪拌速度(> 800 rpm)。使用磁性攪拌棒和螺旋攪拌器，在200 rpm的攪拌速度下，可以觀察到低藥物釋放率和高的標(biāo)準(zhǔn)偏差。然而，隨著攪拌速度提高，釋放速率重現(xiàn)性顯著改善，在等于或高于600 rpm的攪拌速度下，這些曲線可以重合。因此，600以上的攪拌速率是提高釋放速率重現(xiàn)性的優(yōu)選速率。

另外，銳拓實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步對攪拌子的結(jié)構(gòu)研究后發(fā)現(xiàn)，良好的攪拌子結(jié)構(gòu)（下圖）有助于充分混合擴(kuò)散池中的藥液。以KHP標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為樣品，KHP的吸光度在取樣臂&接受池中的數(shù)值為表征，研究了不同轉(zhuǎn)速條件下攪拌取樣臂與接受池中樣品的混合效果，研究中發(fā)現(xiàn)，在不施加攪拌的條件下靜置30sec，取樣臂中的藥物無法通過自由擴(kuò)散達(dá)到混合均勻的效果，取樣臂中的藥物濃度僅為接受池中藥物濃度的1/60。但是在分別施加200rpm及600rpm的攪拌條件下，取樣臂中的藥品濃度與接受池主體中的藥品濃度能夠在30sec內(nèi)迅速達(dá)到均勻，從而解決了取樣臂中藥物濃度與主體藥物濃度不一致的問題，進(jìn)一步有效地避免FDA 1724章節(jié)中描述的負(fù)通量的產(chǎn)生。

2.5最佳條件下市售半固體雙氯芬酸制劑的藥物釋放

基于第一組實(shí)驗(yàn)中獲得的結(jié)果，認(rèn)為以下測試參數(shù)適用于從用于皮膚用的半固體雙氯芬酸制劑中獲得可靠且可再現(xiàn)的體外釋放曲線:32°C、磷酸鹽緩沖液pH 7.4、孔徑為0.45 m的聚砜膜和以800 rpm的攪拌速率。按照USP1724的要求，使用這些設(shè)置進(jìn)行的釋放實(shí)驗(yàn)應(yīng)能夠檢測成品藥物釋放特性的變化。將這些測試參數(shù)應(yīng)用于:

a)新鮮制備的雙氯芬酸鈉水溶液(pH 7.4)，

b)市售的雙氯芬酸凝膠

c)市售雙氯芬酸藥膏藥

探究是否可以確定不同的藥物釋放特征。由此產(chǎn)生的釋放曲線如圖4-5所示。

圖4為雙氯芬酸鈉溶液和凝膠的溶出曲線?？梢郧宄乜吹诫p氯芬酸鈉溶液能夠迅速從膜透過，所以膜對藥物從液體制劑中的擴(kuò)散沒有影響，這表明選擇該膜是正確的。同時(shí)注意到，溶液中的雙氯芬酸鈉擴(kuò)散到受體介質(zhì)中至少需要30分鐘，因此＜30分鐘的取樣點(diǎn)在局部藥物的研究中無分析意義。而在各種凝膠配方中，Diclofenac- ratiopharm gel的藥物釋放速率最高。這與凝膠的稠度非常一致，Diclofenac- ratiopharm gel稠度顯著低于所測試的所有其他配方因此其擴(kuò)散速率也顯著高于其他配方而低于溶液配方。

其余配方表現(xiàn)出相似的釋放曲線。Voltaren Emulgel和Voltaren Schmerzgel的釋放曲線甚至可重合，對arthrex Schmerzgel、Diclac Schmerzgel和Sandoz Schmerzgel的數(shù)據(jù)也進(jìn)行了同樣的比較。仔細(xì)比較這些配方的組成后，這一結(jié)果并不令人驚訝，因?yàn)閮煞NVoltaren產(chǎn)品的非活性成分沒有差異，arthrex Schmerzgel和Sandoz Schmerzgel的非活性成分也是如此。后兩種配方的溶出曲線與Diclac Schmerzgel的相似性無法用產(chǎn)品的組成來解釋，但由于產(chǎn)品注冊用于相同適應(yīng)癥，因此很可能它們被設(shè)計(jì)為生物等效物，這可能會(huì)反映在使用Franz擴(kuò)散池所獲得的體外釋放曲線中。

圖5是乳膏的釋放曲線。顯而易見的是，三種雙氯芬酸乳膏配方中的兩種(Flector Schmerzpflaster和Voltaren Wirkstoffpflaster)也顯示出重合的釋放曲線。然而，基于包裝說明書中給出的信息，這兩種制劑由相同的雙氯芬酸鹽和相同非活性成分組成，因此最有可能的是，這些制劑完全相同，因此也表現(xiàn)出相同的釋放行為。相比之下，Diclofenac-ratiopharm® Schmerzpflaster藥物溶出具有溶出速率大大降低的特征，這與該制劑的組成(不同的雙氯芬酸鹽和不同的非活性成分)相符。

總之，在乳膏釋放實(shí)驗(yàn)中獲得的釋放曲線表明，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，乳膏基質(zhì)控制藥物釋放。

將雙氯芬酸凝膠的釋放曲線與雙氯芬酸乳膏的釋放曲線進(jìn)行比較，顯然，這兩種制劑表現(xiàn)出不同的釋放動(dòng)力學(xué)。雙氯芬酸凝膠中獲得的大多數(shù)釋放曲線可以通過繪制藥物釋放量對得出線性關(guān)系，表明瞬時(shí)釋放速率與1 / √t成比例。對于溶液、懸浮液或乳液類型的半固體制劑系統(tǒng)，這種釋放行為是典型的。相比之下，從乳膏的釋放曲線中可以觀察到幾乎零級的藥物釋放，其中釋放速率由乳膏基質(zhì)控制的。

綜上所述，用最優(yōu)條件的IVRT測試參數(shù)獲得的結(jié)果表明了，IVRT是一種可靠且具有有鑒別能力的體外研究方法，該方法適用于測定用于皮膚用的半固體雙氯芬酸制劑的不同藥物釋放機(jī)制和釋放性質(zhì)。

雖然本研究中的系列實(shí)驗(yàn)側(cè)重于基本方面，但對于闡明開發(fā)用于皮膚應(yīng)用的半固體劑型的體外釋放試驗(yàn)方法過程中的典型陷阱非常有用。使用不同測試參數(shù)設(shè)置獲得的結(jié)果表明，選擇適當(dāng)?shù)臏y試方法對于藥物釋放實(shí)驗(yàn)的成功至關(guān)重要。因此，本研究的結(jié)果可能對準(zhǔn)備開發(fā)或正在開發(fā)半固體制劑的體外釋放方法非常有幫助。

然而，由于藥物性質(zhì)和儀器細(xì)節(jié)都可能對體外藥物釋放研究的結(jié)果產(chǎn)生巨大影響，因此為本研究確定的最佳試驗(yàn)參數(shù)不應(yīng)簡單地適用于其他實(shí)驗(yàn)，具體的實(shí)驗(yàn)參數(shù)取決于垂直擴(kuò)散池的尺寸和藥物性質(zhì)。如本文所述，應(yīng)根據(jù)具體案例建立和驗(yàn)證最佳試驗(yàn)參數(shù)/條件。最后但同樣重要的是，在發(fā)布擴(kuò)散池實(shí)驗(yàn)的設(shè)置和結(jié)果時(shí)，報(bào)告所有相關(guān)的測試參數(shù)對確保所報(bào)告的測試結(jié)果的有效性至關(guān)重要。

參考文獻(xiàn)：Influence of different test parameters on in vitro drug release from topical diclofenac formulations in a vertical diffusion cell setup

Guidance for Industry Nonsterile Semisolid Dosage Forms Scale-Up and Postapproval Changes Chemistry, Manufacturing, and Controls; In Vitro Release Testing and In Vivo Bioequivalence d0cumentation.pdf